Rapido ed etichetta

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 21413 (2022) Citare questo articolo

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In questo lavoro, dimostriamo lo sviluppo di un biosensore elettrochimico rapido e privo di etichetta per rilevare Listeria monocytogenes utilizzando un nuovo materiale nanobrush tiomero di risposta-stimolo. Le nanospazzole sono state sviluppate tramite co-deposizione simultanea in un unico passaggio di nanoplatino (Pt) e tiomeri alginati (ALG-tiomero). La piattaforma nanobrush ALG-tiomero/Pt ha aumentato significativamente la superficie elettroattiva media degli elettrodi di 7 volte e ha mantenuto le proprietà di attuazione (rigonfiamento osmotico stimolato dal pH) dell'alginato. Il comportamento dielettrico durante l'azionamento della spazzola è stato caratterizzato con sonde redox caricate positivamente, neutre e negativamente sopra e sotto il punto isoelettrico dell'alginato, indicando che la carica superficiale del tiomero ALG svolge un ruolo importante nell'acquisizione del segnale. La piattaforma ALG-tiomero è stata biofunzionalizzata con un aptamero selettivo per la proteina internalina A su Listeria per applicazioni di biosensing. Il caricamento dell'aptamero è stato ottimizzato e sono state studiate varie strategie di cattura cellulare (pennello esteso rispetto a collassato). La cattura cellulare massima si verifica quando il tiomero/aptamero ALG si trova nella conformazione estesa (pH > 3,5), seguita dalla misurazione dell'impedenza nella conformazione collassata (pH < 3,5). Basse concentrazioni di batteri (5 CFU mL−1) sono state rilevate da una matrice alimentare complessa (brodo di pollo) e i test di selettività contro altri batteri Gram-positivi (Staphylococcus aureus) indicano che l'affinità per l'aptamero è mantenuta, anche a questi valori di pH. Il nuovo materiale morbido ibrido è tra i più efficienti e veloci (17 minuti) fino ad oggi per il biosensing di L. monocytogenes e non richiede il pretrattamento del campione, costituendo una nuova promettente piattaforma di materiali per il rilevamento di piccole molecole o cellule.

La Listeria monocytogenes è un batterio virulento di origine alimentare ubiquitario nell'ambiente (suolo e acqua) che causa ogni anno centinaia di morti negli Stati Uniti1,2. Ogni anno vengono segnalati quasi 48 milioni di casi di malattie di origine alimentare, quasi il 19% delle quali sono dovute a infezione da Listeria monocytogenes, con un potenziale impatto economico negativo di 15 miliardi di dollari in termini di costi sanitari, perdita di produttività e perdita di vite umane3,4. Con sintomi quali dolore muscolare, nausea, diarrea, vomito e brividi1, la L. monocytogenes è tra i patogeni di origine alimentare più mortali, con un tasso di mortalità fino al 30% nei soggetti ad alto rischio5,6. È particolarmente pericoloso per le donne incinte, anche se generalmente guariscono, i loro bambini potrebbero non sopravvivere2.

Listeria monocytogenes è un patogeno difficile da monitorare negli ambienti di lavorazione alimentare a causa della sua capacità di proliferare in condizioni di basso contenuto di umidità, elevata salinità o alle temperature associate ai comuni frigoriferi/congelatori7. Una regola di tolleranza zero per L. monocytogenes negli alimenti pronti è stata implementata dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense, dal Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e dall’Unione Europea (UE)1 insieme alla regola di tolleranza zero per la L. monocytogenes negli alimenti pronti. il crescente numero di richiami alimentari legati alla contaminazione da Listeria negli ultimi anni8 rafforza ulteriormente la necessità di metodi di rilevamento degli agenti patogeni in tempo reale in grado di identificare i prodotti alimentari contaminati prima che raggiungano il pubblico.

L'attuale stato dell'arte per la rilevazione della Listeria negli impianti di trasformazione alimentare, compresi i conteggi vitali totali (TVC), ELISA (test immunoassorbenti legati all'enzima) e PCR (reazione a catena della polimerasi), sono suscettibili di errori e letture errate, e richiedono strutture di laboratorio costose con personale altamente qualificato per essere completate9,10. I risultati dei test con questi metodi vengono notevolmente ritardati poiché richiedono due fasi di arricchimento consecutive (fino a 48 ore) per concentrare/amplificare i batteri prima di una fase di rilevamento qualitativo11, poiché questi metodi mancano di sensibilità [~ 100 CFU mL−1 limiti di rilevamento (LOD) ]12,13 e non sono in grado di rilevare direttamente bassi livelli di agenti patogeni in campioni complessi come terreni, brodo o tessuti omogeneizzati.

0.97), the sensitivity to the target bacterium was obtained using the slope of the linear portion and then the 3σ method was used to calculate the limit of detection (LOD)39. Change in impedance (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{bacteria}-{Z}_{no \, bacteria}\)) was used to illustrate the electrodes performance independent of media. Selectivity to L. monocytogenes was evaluated by determining sensitivity and LOD in the presence of the identical concentration of another Gram-positive bacteria (S. aureus) in PBS and in sterile vegetable broth./p>

3.5 is noted as (EX), the collapsed brush conformation at pH < 3.5 is noted as (COL), the cell capture state is noted by (cap) and the electrochemical measurement step is noted by (meas). Cell capturing in the extended conformation (pH 7) and sensing at collapsed state (pH 3) provided the highest impedance values (p < 0.05) for all cutoff frequencies and, therefore, sensing efficiency (see also Bode plots in Fig. S3 in the supporting information). The optimum capture of targeted bacteria at the extended form can be related to a higher contact area with the tested solution and an increased probability of aptamer-cell interaction, compared to pH 3 at which the brushes are contracted, and the receptor binding site(s) may be inaccessible. Similar to our previous work on this capture strategy, it is likely that the cells become entangled in the polymer matrix during the sensing step, where aptamer-target binding may no longer be the mechanism for cell capture but rather entanglement during nanobrush collapse. The specificity for this detection platform is rooted in the initial affinity between aptamer and target at pH 7 (extended ALG-thiomer nanobrush), where the collapse at pH 3 likely causes secondary structure changes in the aptamer but also entraps cells in the polymer matrix./p> 0.05) on the LOD (4.5 ± 0.8 CFU mL−1 with L. monocytogenes alone and 5.7 ± 2.1 CFU mL−1 with both bacteria) indicating no cross-reaction between the sensor and S. aureus. The sensitivity increased (p < 0.05) from 39.21 ± 2.61 Ω/log(CFU mL−1) with L. monocytogenes alone to 69.34 ± 2.79 Ω/log (CFU mL−1) when S. aureus was also present. The linear range also changed from 101 to 106 CFU mL−1 with only L. monocytogenes in PBS to 101–105 CFU mL−1 in the bacteria mixture. Ohk et al.29 presented a LOD of 103 CFU mL−1 using the same aptamer in a fiber-optic biosensor to detect Listeria spp. Recently, Oliveira et al.31 using the same aptamer presented similar LODs compared to the current study for L. monocytogenes alone in PBS and in the presence of S. aureus, 2.5 and 2.6 CFU mL−1, respectively; using actuation of chitosan/platinum brushes. While antibody sensors are reported to be prone to give false-positive reactions with S. aureus, which is also a protein A carrier, the aptamer used in the present work was proven to be selective to L. monocytogenes29. This aptamer targets the surface protein Internalin A which is one of the major invasion proteins involved in pathogenesis29. Despite the fact that this protein is structurally analogous to certain cell-wall proteins with internal repeats identified in members of the genera Staphylococcus and Streptococcus65, the present results corroborate that this aptamer can be selective to L. monocytogenes./p> 0.05) to the results in PBS. These results also indicate that the aptamer is able to selectively bind to L. monocytogenes even in complex food matrices. Using the same aptamer, Hills et al.30 reported a slightly higher LOD of 9.1 CFU mL−1 in vegetable broth with a layer by layer reduced graphene oxide/nanoplatinum/chitosan brush electrode that actuated based on chitosan's pH-response./p>

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